CITSens Bio Application Note Schuettler TFlaschen - 1 Seiten

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Katalogauszüge

Integration und Charakterisierung von CITSens Bio Sensoren in disposable Bioreaktoren mit CHO-Zellkulturen Lidija Lisica, T. Schopper (ZHAW), S. Spichiger (C-CIT AG) Einleitung Die FDA macht in ihrer neuen Guidline „Guidance for Industry PAT (Process Analytical Technology) – A Framework for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacturing, and Quality Assurance“ darauf aufmerksam, dass in Produktionsprozessen, wo immer möglich, eine kontinuierliche Echtzeit Qualitätssicherung durchgeführt werden sollte.Um diesem Anspruch auch in Einwegbioreaktoren genüge zu tun, sind neue Methoden für die Prozesskontrolle erforderlich. In jüngster Zeit sind daher einige neue Sensorsysteme auf dem Markt erschienen, welche als Einwegsensoren mit den Einwegreaktoren entsorgt werden können. Diese Sensoren werden als in-line Sensoren, direkt oder über die Deckel, in die Einwegreaktoren eingebaut und liefern ein kontinuierliches Signal für die kontinuierliche Prozessüberwachung. In dieser Arbeit wird ein solcher Sensor (CITSens Bio) für die Glucosemessung vorgestellt. Der Sensor basiert auf einer Siebdruckelektrode, welche mit einem Funkmodul verbunden ist. Das Funkmodul nimmt die Daten auf und überträgt diese kabellos und kontinuierlich aus dem Brutschrank an eine zentrale Erfassungseinheit. Vorgehen In einem ersten Versuch wurden die Glucosesensoren CITSens Bio in Deckel von 250 ml Schüttelflaschen eingebaut. In einem zweiten Versuch wurden die Glukosesensoren CITSens Bio in T75-Flaschen von TPP eingebaut und darin adhärente Zellen gezogen. Die Flaschen wurden mit FMX-111 Medium gefüllt. Anschliessend wurden die Deckel mit den Sensoren auf die Reatkoren geschraubt und der Sensor mit dem BioBeamer verbunden. Die Reaktoren wurden zusammen mit den BioBeamern in den Zellkulturschrank gestellt und über Nacht bei 37°C, 60 rpm (Nur Schüttelkolben) und 10% CO2 inkubiert. Am darauf folgenden Tag war das Medium immer noch klar, was ein Indiz für Keimfreiheit ist. Nach 12h wurden die Schüttelkolben mit CHO-Zellen beimpft und der Sensor kalibriert. Die Kultivierungsdauer betrug im ersten Versuch 4.5 Tage und im zweiten Versuch 13 Tage. Dabei wurde die Glukoseabnahme sowohl mit dem CITSens Bio on-line und off-line mit dem Bioprofile von NovaBiomedical verfolgt. Die Kultur wurde über die stationäre Phase hinaus bis in die absterbe Phase kultiviert. Resultate In dem Graphen rechts ist der Glukoseverlauf in der CHO-Zellkultur in den Schüttelflaschen in FMX-111 Medium abgebildet. Die Zellkultur wurde mit 3.6 g/l Glukose gestartet. Der Sensor wurde richtig kalibriert und auch die off-line Methode zeigt den Glukosegehalt korrekt an. Auffallend ist die schnelle Glukoseabnahme am Ende des Prozesses, welche sowohl durch das Bioprofile wie auch durch den on-line Sensor CITSens Bio angezeigt wird. Es konnte festgestellt werden, dass die Zellen in dieser Phase bereits in der Absterbephase waren. Es wird vermutet, dass durch die Zelllyse die Enzyme in den Zellen frei ins Medium gelangen, damit ist der Umsatz nicht mehr durch die Zellmembran limitiert sondern die Enzyme haben freien Zugang zu der Glukose. Dies hat zur Folge, dass der Glukoseumsatz beschleunigt wird. Diese Theorie ist jedoch nicht bestätigt. Die “CITSens Bio” wurden über zwei Wochen in einer adhärenten CHO K1 Zellkultur zur Glukoseüberwachung eingesetzt. Als Referenz für die permanenten in-line Überwachung wurden täglich Proben gezogen und mittels HPLC und Bioprofile analysiert. Ebenso wurde der Sensor auf seine Zellverträglichkeit untersucht. Die Integrität des Systems war über zwei Wochen gewährleistet. Die Sterilität der Kultur konnte mit der Adaption garantiert werden. Die Zellen wurden über einen Zeitraum von 4.5 Tagen kultiviert. Der Glukoseverlauf wurde sowohl mit dem BioProfile der Firma Nova Biomedical und dem on-line Sensor CITSens Bio aufgezeichnet. Wie zu erkennen ist, stimmt der Glukoseverlauf beider Methoden überein. Die Peaks beim online Sensor stammen von der Probenahme, bei welcher der Sensor aus dem Medium genommen wird. Das praktische Handling beim Einsatz der Hardware war mit wenig Übung bequem zu vollziehen. Über die gesamte Einsatzdauer wurden Resultate in guter Übereinstimmung mit den Referenzmethoden erreicht. Im punktuellen Vergleich weichen die Werte 0.16 ± 0.09 g L-1 vom HPLC ab und befinden sich damit in der Grössenordung der Differenz des Bioprofiles zum HPLC; 0.14 g ± 0.13 g L-1. Das System gilt als vollumfänglich bio-kompatibel. Der Vorteil als in-line Messsystem gegenüber den off-line Methoden wird in der vierten Passage deutlich, wo beide CITSens Bio, über die Stagnation des Glukoseverbrauchs, einen Wachstumsstop anzeigen. Das erreichen der vollständigen Konfluenz wird mit der täglichen offline Messung über HPLC und Bioprofile nicht erfasst. Neben der Wachstumsphasen können auch eventuelle Kontaminationen einfach und schnell erkannt werden. Wird eine Zellkultur durch Bakterien verunreinigt, ändert sich die Abnahme der Glukosekonzentration sehr schnell. Diese beschleunigte Glukoseabnahme wird im Graphen sofort ersichtlich. Abbildung 3: Glukosemessung in einer CHO K1 Zellkultur über die Dauer von zwei Wochen. Dargestellt sind vier Wachstumsphasen mit drei Passageschritten. Die gute Korrelation zwischen den beiden LoCoSens (Gamma 2 & 3) und den Referenz-methoden HPLC und Bioprofile ist ersichtlich.

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