Tücken der UHPLC Wissenswertes im Bereich < 2 Mikronpartikel Rapid Resolution High Definition - RRHD Säulen Rapid Resolution High Throughput - RRHT Säulen Rapid Resolution Cartridge – Kartuschensäulen (Poroshell120) Dr. Ulrike Jegle Produktspezialistin Säulen Agilent Technologies

Ultra-schnelle und hochauflösende Analyse Wann nutze ich welche Säule?! ultra-schnelle Analyse: • Hohe Probenzahl oder schnelle • kurzer, generischer Gradient • Kurze Säule • Hohe Flussrate Hochauflösende Analyse: Trennung jeder Komponente, • lange Gradienten • lange Säule • „normale" bis hohe Flussrate Partikel- / Matrix-haltige Proben: • für Proben die warhscheinlich die Fritten und Zwischenpartikelplätze blockeren würden und für schnelle Analysen • Maximierung der Auflösung bei moderatem Druck

Wie unterscheiden sich Agilent sub2 micron Säulen? Alle Säulen enthalten die identischen Partikel, sie sind aber in unterschiedliche Hardware gepackt. Die Selektivität ist also identisch! 5 um Kartuschensäulen – 400 bar RRHT – 600 bar 1.8 um <2micron RRHD – 1200 bar

RRHT Eclipse Plus C18 RRHD Eclipse Plus C18

Kurzform: ZORBAX Säulenauswahlhilfe 600+ bar Fast High Rs 400 bar LC UHPLC Analysis (N) “Fitness” “Fitness” Kartuschen 400 bar RRHT 600 bar RRHD 1200 bar Scalability of Particle 1.8, 3.5um etc. ID’s 4.6, Dirty 3.0 & 2.1 Samples? mm ja ja ja nein ja ja möglich ja ja möglich möglich ja ja möglich ja ja nein ja ja nein möglich Stable Bond Familie < 50 mm Eclipse XDB/Plus Familie Bonus RP 3.0 & 2.1 Extend C18

Schutz RRLC Säulen vor zu hohen Drücken > 400/600 bar Page 6

Schnelle und hochauflösende Analyse – HPLC/UHPLC Für schnelle und hochauflösende Analysen gelten bezüglich der RRHT, RRHD und Poroshell120 die selben Regeln. Geschwindigkeit und Auflösung können nicht in einem Schritt maximiert werden. Auflösung braucht Zeit! Gegensätzliche Forderung tR ∝ L N ∝ L Diese Zusammenhänge gelten für sub 2 Mikron und Poroshell120 Säulen gleichermassen.

Schnelle Trennungen - Reduktion der Säulenlänge Wie hält man die Effizienz konstant? Diese Zusammenhänge gelten für sub 2 Mikron und Poroshell120 Säulen gleichermassen.

Schnelle Trennungen – Reduktion der Säulenlänge unter Erhalt der Effizienz Reduktion der Säulenlänge Säule 1: 4.6 mm x 150 mm, 5.0 µm Reduktion der Partikelgröße Säule 2: 4.6 mm x 50 mm, 1.8 µm, total porös 2.7 um Poroshell 120 Dies gilt für sub 2 Mirkon und Poroshell Partikel gleichermasen.

Maximale Geschwindigkeit Optimaler Einsatz von RRHT für HPLC/UHPLC Peak 1 2 TR 0.40 0.69 N 2991 4025 Rs 0 6.9 Rapid Resolution HT Säule (L1) ZORBAX Eclipse XDB-C18: 4.6x30mm, 1.8um P/N 923975-902 Eluent: 60% Methanol:40% Wasser, Fluss: 1.5 mL/min Injektion: 1uL, Temp: 25 C 2 1 ACHTUNG! optimiertes LC-System nötig optimiertes Verzögerungvolumen optimiertes Extrasäulenvolumen auch bei 400 bar Säulen 0 1 min RRHT/D liefert bei minimiertem Verzögerunsvolumen maximale Geschwindkeit für ultra-schnelle Analysen. Verzögerungsvolumen kostet Zeit. Page 10

Beschleunigung durch Erhöhung der Flussrate unter Erhalt der Auflösung Kleingedrucktes der van Deemter Kurve 0.0045 0.0040 0.0035 0.0030 5.0 μm HETP (cm/plate) 0.0025 0.0020 3.5 μm 0.0015 0.0010 1.8 μm, 2.7 μm 0.0005 0.0000 1 mL/min -0.0005 0.0 0.2 0.4 0.6 2 mL/min 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1. Van Deemter Kurven gelten nur für isokratische Läufe 2. Van Deemter Kurven sind substanzspezifisch 3. Van Deemter Kurven sind auch für sub-2-μm oder 2.7 um teilporöse Partikel nicht horizontal, sondern nur flach. Lineargeschwindigkeit (ue- cm/sec) • Flussratenerhöhung um 100% • Reduktion der Laufzeit um 50% •...

RRHD/RRHT: kurze 50mm Säulen mit typischen ACN-Gradientenbedingungen liegen unter 600 bar Probe: Octyl-Dimethyl-para-aminobenzoesäure Säule: RRHD Eclipse Plus C18 3 x 50mm 1.8um,

Schnelle Trennung mit hoher Auflösung RRHD Säule und Agilent 1290 Infinity LC Octyl-dimethyl para-Aminobenzoesäure Säule: RRHD Eclipse Plus C18, Flussrate. 0.74 ml/min (entspricht 3.5 ml/min für 4.6 längere Säule mit höherer Flussrate für mehr Auflösung in nur wenig längerer Zeit

Ausnutzen der Methanol Selektivität Rückdruck stellt kein Problem dar I | DAD1 E. DAD1D, DAD Signal D, 320 nm/Bw 4 nm (WOOOMAN_MA 00MEOH3 2009-03-22 14-1S-02\F02X100_MEOH28 D) Octyl-dimethyl para-Aminobenzoesäure Säule: RRHD Eclipse Plus C18

Schnelle Analyse mit Agilent ZORBAX Rapid Resolution High Definition Eclipse Plus C18 Mobile Phase ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 x 50 mm, 1.8 1.6 mL/min ist eine sehr hohe Flussrate für schnelle Trennungen Daten: Gerd Vanhoenacker Forschungsinstitut für Chromatographie Kennedypark 26 8500 Kortrijk Belgien

Schnelle Analyse: ZORBAX Rapid Resolution High Definition Eclipse Plus C18 RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 x 50mm, 1.8um, Diese Probe mit 10 Komponenten benötigt einen Gradienten, der zu Drücken über 1000 Daten: Gerd Vanhoenacker Kennedypark 26 8500 Kortrijk Belgium

Hohe Auflösung gegen Analysenzeit Höhere Säulenlänge Säulen: RRHD SB-C18, 2.1 mm ID, Länge siehe Abbildung, Mobile Phase: 60 %Wasser:Acetonitril, Flussrate: 0.5 mL/min, Temp: RT, Peaks: 1: Uracil, 2 Acetophenon, 3 pPopiophenon, 4 Butyrophenon, 5 Valerophenon, 6 Hexanophenon

Zugewinn: Effizienz & Auflösung mit langen Säulen Hohe Auflösung Rs in 3.5 Minuten, 250mm, 1.8um bei ZORBAX RRHD SB-C18, 1.8um Säulen Mobile Phase 25:75 WassenAcetonitril, Flussrate: 0.5 mL/min, Raumtemperatur